kimia itu asyk: Isolasi DNA

PERCOBAAN V

ISOLASI DNA

I. Tujuan

Adapun tujuan pada percobaan ini yaitu untuk mengisolasi DNA buah-buahan yaitu buah mangga, buah pisang, buah alpukat, buah papaya an buah nenas

II. Dasar Teori

Asam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang memegang peranan sangat penting dalam kehidupan organisme karena di dalamnya tersimpan informasi genetik. Asam nukleat sering dinamakan juga polinukleotida karena tersusun dari sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Tiap nukleotida mempunyai struktur yang terdiri atas gugus fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen atau basa nukleotida (basa N).

Ada dua macam asam nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat atau deoxyribonucleic acid (DNA) dan asam ribonukleat atau ribonucleic acid (RNA). Dilihat dari strukturnya, perbedaan di antara kedua macam asam nukleat ini terutama terletak pada komponen gula pentosanya. Pada RNA gula pentosanya adalah ribosa, sedangkan pada DNA gula pentosanya mengalami kehilangan satu atom O pada posisi C nomor 2’ sehingga dinamakan gula 2’-deoksiribosa (Anonim, 2012).

Perbedaan struktur lainnya antara DNA dan RNA adalah pada basa N-nya. Basa N, baik pada DNA maupun pada RNA, mempunyai struktur berupa cincin aromatik heterosiklik (mengandung C dan N) dan dapat dikelompokkan menjadi dua golongan, yaitu purin dan pirimidin. Basa purin mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai satu cincin (monosiklik). Pada DNA, dan juga RNA, purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G). Akan tetapi, untuk pirimidin ada perbedaan antara DNA dan RNA. Kalau pada DNA basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T), pada RNA tidak ada timin dan sebagai gantinya terdapat urasil (U). Timin berbeda dengan urasil hanya karena adanya gugus metil pada posisi nomor 5 sehingga timin dapat juga dikatakan sebagai 5-metilurasil (Webly, 2011).

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) merupakan materi genetik yang tersimpan dalam inti sel sehingga hanya dapat diisolasi jika sel dan membran inti dipecah. Materi ini merupakan polimer dari empat macam nukleutida yang hanya berbeda pada komponen basanya, yaitu adenin (A), timin (T), sitosin (C), dan guanin (G). Setiap nuleotida terdiri dari tiga komponen yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan gugus fosfat (Anonim, 2012)

Adanya gugus fosfat menyebabkan DNA bersifat polar sehingga dapat larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik seperti etanol. DNA mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 260 nm. Sedangkan protein mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 280 nm. DNA murni mempunyai nilai perbandingan OD₂₆₀ : OD₂₈₀ ³ 1,8. Larutan DNA dengan OD₂₆₀ = 1 memiliki konsentrasi 50 ng/mL. Molekul DNA di dalam eukariot bergabung dengan protein dan dikelompokan menjadi serabut kromatin di dalam inti sel yang dikelilingi oleh sistem membran ganda yang bersifat kompleks. Nukleutida berikutnya pada DNA berikatan secara kovalen satu dengan yang lainnya melalui jembatan gugus fosfat. Jembatan tersebut dinamakan ikatan fosfodiester. Tulang punggung DNA bersifat sangat polar, karena gugus fosfat bersifat asam dan bermuatan negatif pada pH sel. Sebaliknya, basa purin dan pirimidin relatif tidak larut sehingga bersifat hidrofobik (Endik, 2009).

Petunjuk paling penting mengenai struktur DNA diperoleh dari penemuan Erwin Chargaff di Universitas Columbia pada akhir tahun 1940. Mereka menemukan bahwa kelompok basa terdapat dalam nisbah yang berbeda pada DNA berbagai organisme dan basa-basa tersebut berhubungan satu dengan lainnya secara kuantitatif. Dari penemuan tersebut, Chargaff menyimpulkan:

1. Potongan DNA yang diisolasi dari berbagai jaringan spesies yang sama memiliki komposisi yang sama.

2. Komposisi basa DNA bervariasi dari satu spesies ke spesies yang lain.

3. Komposisi basa DNA pada spesies tertentu tidak berubah dengan bertambahnya unsur organisme atau bertambahnya tingkat nutrisi atau berubahnya lingkungan (Anonim, 2012).

III. Alat dan Bahan

Adapun alat dan bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu :

A. Alat

1. Sendok dan garpu 8. Neraca digital

2. Gelas kimia 9. Batang pengaduk

3. Corong 10. Spatula

4. Tabung reaksi 11. Loyang

5. Rak tabung reaksi 12. Talenan

6. Gelas arloji 13. Kertas saring

7. Pisau 14. Kertas label

B. Bahan

1. Buah mangga

2. Buah pisang

3. Buah pepaya

4. Buah alpukat

5. Buah nenas

6. Aquades

7. Garam dapur

8. Es batu

9. Etanol absolut dingin

10. Sunlight

IV. Prosedur Kerja

Adapun prosedur kerja pada percobaan ini yaitu :

1. Mengupas buah mangga kemudian menggerusnya setelah itu memasukkannya ke dalam gelas kimia sebanyak 20 ml.

2. Menambahkan 8 gram garam dapur kemudian melumatkannya dengan perlahan-lahan.

3. Menambahakan 20 ml campuran sunlight dan aquades 1:1 dan memasukkan lagi aquades 20 ml setelah itu mengaduknya perlahan-lahan sampai homogeny, selanjutnya mendiamkannya selama 15 menit.

4. Menyaring ekstrak tesebut dengan menggunakan corong yang dilapisi kertas saring saring dan memasukkan filtratnya ke dalam tabung reaksi sekitar ¼ volume tabung.

5. Menambahkan etanol absolute yang telah didinginkan memalui dinding tabung reaksi secara perlahan-lahan setelah itu mengamati perubahan yang terjadi.

6. Hasil positif terlihat dengan adanya 3 lapisan yaitu lapisan dasar adalah ekstrak buah, lapisan tengah etanol absolut dan lapisan atas massa putih (DNA).

7. Mengulangi langkah di atas untuk buah pisang, pepaya, nenas dan alpukat.

V. Hasil Pengamatan.

Adapun hasil pengamatan yang diperoleh yaitu :

Perlakuan

a. Buah mangga + 8 gram NaCl + dilumatkan

b. Buah pepaya + 8 gram NaCl + dilumatkan

c. Buah nenas + 8 gram NaCl + dilumatkan

d. Buah pisang + 8 gram NaCl + dilumatkan

e. Buah alpukat + 8 gram NaCl + dilumatkan

a. Langkah 1a + larutan sabun + diaduk

b. Langkah 1b + larutan sabun + diaduk

c. Langkah 1c + larutan sabun + diaduk

d. Langkah 1d + larutan sabun + diaduk

e. Langkah 1e + larutan sabun + diaduk

a. Langkah 2 a + disaring

b. Langkah 2 b + disaring

c. Langkah 2 c + disaring

d. Langkah 2 d + disaring

e. Langkah 2 e + disaring

a. Langkah 3 a + larutan etanol absolit dingin sebanyak 3 tetes

b. Langkah 3 b + larutan etanol absolit dingin sebanyak 3 tetes

c. Langkah 3 c + larutan etanol absolit dingin sebanyak 3 tetes

d. Langkah 3 d + larutan etanol absolit dingin sebanyak 3 tetes

e. Langkah 3 f + larutan etanol absolit dingin sebanyak 3 tetes

Hasil

Warna orange

Warna merah

Warna kuning

Warna putih susu

Warna hijau

Warna coklat muda

Warna hijau muda

Warna hijau pucat

Warna hijau

Filtratnya berwarna hijau bening dan residunya berwarna hijau

Filtratnya berwarna hijau bening dan residu berwarna coklat muda

Filtratnya berwarna hijau keruh dan residunya berwarna hijau muda

Filtratnya berwarna putih keruh dan residunya berwarna hijau pucat

Filtrak berwarna coklat dan residu berwarna hijau

Terbentuk dua lapisan, lapisan atas etanol absolute dingin lapisan bawah ekstrak mangga

Terbentuk dua lapisan, lapisan atas etanol absolute dingin lapisan bawah ekstrak pepaya.

Terbentuk tiga lapisan lapisan bawah ekstrak nenas, lapisan atas DNA dan tengah etanol absolut dingin

Terbentuk dua lapisan, lapisan atas etanol absolute dingin lapisan bawah ekstrak alpukat.

VI. Pembahasan

DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa nitrogen. Sebuah unit monomer DNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehingga DNA tergolong sebagai polinukleotida Rantai DNA memiliki lebar 22-24, sementara panjang satu unit nukleotida 3,3. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil DNA dapat memiliki jutaan nukleotida Yang terangkai seperti rantai. Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya (Anonim, 2012).

Adapun tujuan dilakukannya percobaan ini yaitu untuk mengisolasi DNA dari buah-buahan dimana buah yang digunakan pada percobaan ini yaitu mangga, pisang, nenas, pepaya, dan alpukat. Prinsip percobaan ini yaitu mengekstrak DNA yang terdapat pada inti sel dengan cara memecah membran sel dan menarik DNA di dalamnya dengan air. Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan

(Webly, 2011).

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Anonim, 2012).

Pada perlakuan yang pertama yakni menggerus buah mangga dengan menggunakan sendok dengan hati-hati dan secara perlahan setelah itu memasukkannya ke dalam gelas kimia sebanyak 20 ml. Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah deterjen. perlakuan selanjutnya menambahkan 8 gram garam dapur setelah itu melumatkannya kembali secara perlahan-lahan sampai tercampur adapun tujuan dari penambahan garam dapur pada percobaan ini yakni Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya mebran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia membantu proses pemecahan sel dan membran sel ataupun membran inti sehingga memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah teramati serta garam dapur berfungsi untuk mempertahankan pH adapun warna yg terbentuk yakni orange. Pada perlakuan berikutnya menambahkan 20 ml larutan sabun sambil mengaduknya perubahan yang terjadi yakni warnanya berubah menjadi hijau. Fungsi dari penambahan larutan sabun pada percobaan ini yakni memecah membran inti sel agar DNA terekstrak keluar. Penambahan deterjen didasarkan pada pemisahan DNA dengan protein dalam nukleuprotein yaitu pertukaran dan kation antara deterjen dengan nukleuprotein. Secara umum dapat digambarkan sebagai berikut:

Protein nukleat + RCOONa ––→ RCOOprotein + Na-nukleat

Setelah DNA terpisah dari protein, selanjutnya ditambahkan auades 20 mL untuk memisahkan DNA dari senyawa-senyawa atau pengotor yang tidak larut dalam air. Setelah itu dilakukan penyaringan untuk memisahkan zat pengotor yang tidak larut dalam air dengan DNA yang larut dalam air kemudian setelah itu mengaduknya dan mendiamkannya selama 15 menit. Adapun tujuan dari pengadukan yakni untuk menghomogenkan campuran tersebut serta tujuan pendinginan yakni untuk mempercepat pemisahan DNA. Langkah berikutnya menyaring campuran tersebut dengan menggunakan corong yang telah dilapisi dengan kertas saring tujuannya yakni untuk memisahkan filtrat dengan residunya Agar komponen sel selain DNA tidang mengkontaminasi DNA yang hendak diisolasi. dimana warna filtrate yang diperoleh yakni hijau bening dang residunya berwarna hijau setelah itu, memasukkan Filtrat yang diperoleh ke dalam tabung reaski kemudian metambahkan 3 mL etanol dingin melalui dinding tabung secara perlahan-lahan. Adapun tujuan dari penambahan etanol absolut yakni untuk mengeluarkan DNA, karena DNA tidak larut dalam etanol. Ketika ditambahkan etanol basa nitrogen dari DNA akan tertarik ke arah etanol demikian pula bagian DNA yang lain. Karena DNA relatif tidak larut dalam etanol maka akan membentuk agrerat berupa benang-benang halus berwarna putih pada permukaan etanol serta mempermudah presipitasi asam nukleat polimirin dengan baik sehingga dapat meningkatkan konsentrasi DNA adapun tujuan penambahan etanol melalui dinding tabung agar tidak merusak DNA yang akan terbentuk serta menghindari agar etanolnya tidak cepat menguap dimana diketahui etanol merupakan zat yang cepat menguap. Adapun hasil yang diperoleh yakni diperoleh yakni terbentuk dua lapisan yakni lapisan bawah ekstrak mangga dan lapisan atas etanol absolute dingin hal ini menandakan bahwa pada percobaan dengan menggunakan ekstrak mangga tidak berhasil karena hasil posotifnya terlihat dari terbentuknya 3 lapisan dimana lapisan bawah ekstrak, lapisan tengah etanol dan lapisan atas massa putih yang merupakan DNA. Kesalahan ini mungkin disebabkan karena pada waktu penyaringan tidak dilakuakan secara sempurna sehingga tidak terbentuk lapisan massa putih (Endik, 2009).

Pada perlakuan yang selanjutnya yakni dengan menggunakan buah pepaya, nenas, pisang dan alpukat dengan perlakuan yang sama seperti diatas diperoleh hasil pada penambahan garam dapur ekstrak buah papaya berwarna merah, ekstrak buah nenas berwarna kuning, ekstrak buah pisang berwarna putih susu dan terakhir ekstrak buah alpukat berwarna hijau. Pada penambahan larutan sabung pada ekstrak buah pepaya warnanya berubah menjadi coklat mudah, pada ekstrak buah nenas warnanya berubah menjadi hijau muda, pada ekstrak buah pisang warnanya berubah menjadi warna hijau pucat dan pada buah alpukat warnanya menjadi hijau. Setelah dilakukan penyaringan pada buah pepaya filtratnya berwarna hijau bening dan residunya berwarna coklat muda, pada buah nenas filtratnya berwarna hijau keruh dan residunya berwarna hijau muda, pada buah pisang filtratnya berwarna putih keruh dan residunya berwarna putih susu dan pada buah alpukat filtratnya berwarna coklat dan residunya berwarna hijau. Perlakuan yang terakhir yakni penambahan etanol absolute yang dingin diperoleh hasil pada ekstrak buah papaya dan alpukat terbentuk dua lapisan yakni lapisan atas etanol absolute yang dingin dan pada lapisan bawah ekstrak buah sedangkan pada buah nenas dan pisang terbentuk tiga lapisan yakni lapisan bawah ekstrak buah, lapisan tengah etanol absolute dan lapisan atas DNA.

Dari hasil yang diperoleh maka dapat diketahui bahwa sampel yang berhasil pada percobaan ini yakni sampel ekstrak buah nenas dan pisang sedangkan yang buah mangga, pepaya dan alpukat gagal. Hasil isolasi DNA yang diperoleh sangat dipengaruhi oleh jenis buah dan deterjen yang digunakan. Terbukti dari hasil pengamatan, pada masing-masing buah didapatkan hasil yang berbeda,

VII. Kesimpulan

Adapun kesimpulan yang dapat diperoleh berdasarkan tujuan dan hasil pengamat yaitu :

1. isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA.

2. Dari hasil yang diperoleh maka sampel yang dapat diisolasi DNA nya yakni ekstrak nenas dan pisang sedangkan ekstrak mangga, pepaya, dan alpukat tidak.