HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.Kolom dan pelarut
Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.
Kromatografi gas adalah salah satu mode pemisahan kromatografi yang digunakan untuk Memisahkan semua zat yang berbentuk uap/gas atau dapat diuapkan ,tanpa mengalami penguraian dan menggunakan gas sebagai fase geraknya.prinsip kerja dari metode kromatografi gas adalah menyuntikkan contoh kedalam ujung kolom kromatografy gas,lalu contoh tersebut diuapkan dan dielusi oleh gas inert yang digunakan sebagai fase geraknya.perbedaan yang cukup mencolok dari sebagian besar metode kromatografi lainnya yaitu terletak pada fase geraknya .fase gerak yang digunakan tidak ikut berinteraksi dengan senyawa atau molekul dari alat tersebut,sehingga fase gerak yang digunakan hanya berfungsi sebagai zat yang membawa alat kedalam kolom. Keuntungan dari analisis menggunakan kromatografi gas adalah kecepatan analis yang relative lebih cepat dalam memisahkan komponen dari suatu senyawa yang tentunya sangat beragam.selain itu kromatografi gas dapat memisahkan senyawa-senyawa yang memiliki perbedaan titik didih yang sangat kecil dan tidak mungkin dipisahkan dengan cara penyulingan atau cara lain.
Analisis dengan menggunakan kromatografi gas merupakan salah stu teknik analisis yang memiliki tingkay kepekaan yang sangat tinggi,sehingga dapat digunakan untuk analisis dengan rentang yang sangat luas kepekaan dari kromatografy gas adalah dapat mendeteksi sampai satuan ppb (part per billion).keuntungan tambahan dari tingkat kepekaan yang tinggi adalah cuplikan yang diperlukan sangat sedikit sekali .dengan beberapa mikroliter saja,sudah mampu untuk menganalisis secara lengkap .komponen-komponen kromatografi gas umumnya terdiri atas tangki gas pembawa ,injector ,kolom berikut oven ,detector dan system pengolah data.
Kromatografi gas-cair (biasa disebut kromatografi gas) merupakan analisis yang sangat bermanfaat.
Fase normal HPLC
Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai, ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC.
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
Fase balik HPLC
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.
Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
BAB II PEMBAHASAN
A. Komponen-komponen pada HPLC
Pada gambar diatas dapat terlihat bahwa komponen-komponen dari HPLC yaitu
a.tempat sampel
b. injektor
c. detektor
d. pompa
e. mesin pengendali
untuk lebih lengkapnya bagian-bagian dari HPLC yaitu
1. Tempat sampel
Tempat sampel berfungsi untuk mengimpan sampel yang akan dipisahkan dalam HPLC dimana sampel yang digunakan disimpan dalam botol kemudian dimasukkan kedalam tempat tersebut. Tempat ini menyimpan banyak botol sampel hal inilah yang menjadi kelebihan dari proses pemisahan dengan menggunakan HPLC karena dapat memisahkan sampel dengan jumlah yang banyak.
2. Injektor
Injektor adalah alat yang digunakan untuk menginjeksi sampel yang akan dipisahkan.Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b. Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.
3. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: (1) mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel; (2) mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil; (3) stabil dalam pengopersiannya; (4) mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita; (5) signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier); dan (6) tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak2)
4. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni: Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
• Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
• Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
6. Botol pelarut
Botol pelarut merupakan wadah tempat menyimpan eluent yang akan digunakan untuk mengaliri fasa diam. Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnyapolaritaspelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritasyangluas4).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik
7. Selang penghubung
Selang penghubung yaitu berfungsi untuk menghubungkan eluent dengan kolom
8. Mesin pengendali
Mesin pengendali merupakan bagian yang terpenting dalam proses pemisahan ini karena mesin pengendali berfungsi sebagai sebagai alat untuk mengendalikan semua proses pemisahan yang sedeng berlangsung.
9. Komputer
Kumputer merupakan alat yang digunakan untuk membaca pembacaan kromatogram yang telah dihasilkan pada perconbaan ini.
B. PRINSIP DASAR DAN CARA KERJA DARI HPLC
1. Prinsip dasar dari HPLC
Prinsip dasar dari HPLC yaitu didasarkan pada partisi cair-cair Teknik ini terdiri dari suatu kolom yang berisi zat padat penunjang halus di mana pada permukan terdapat pelarut sebagai fase diamnya. Fase kedua, yaitu fase bergerak yang tidak bercampur dengan cairan dari fase diamnya akan mengalir sepanjang kolom. Komponen-komponen yang terpartisi lebih banyak pada fase diam akan bertahan lebih lama di dalam kolom dibandingkan yang lebih banyak terpartisi pada fase gerak.
2. Cara kerja dari HPLC
Prinsip kerja HPLC ialah dengan bantuan pompa fase gerak cair dialirkan melalui kolom menuju detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikkan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fase diam Solut-solut yang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebalikya, solute-solut yang kuat berinteraksinya dengan fase diam maka solute tersebut akan keluar kolom, dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah hasil data pengukuran HPLC.
1. HPLC dihubungkan dengan sumber arus, lalu computer, monitor, dan printer dinyalakan.
2. Pompa HPLC dan detector UV dengan cara menekan tombol ON/OFF pada masing-masing alat.
3. Lalu Analiyst Komputer dipilih.
4. Setelah itu membuka LC Solution. 5. Kondisi eluen dicek terlebih dahulu, jika terdapat gelembung udara harus disaring dengan menggunakan saringan 0,45 mikron. Kemudian dick kembali cairan eluen yang menuju pompa. Apabila juga masih terdapat gelembung udara maka harus dilakukan PURGE menggunakan drain dengan tujuan mengeluarkan udara dari eluen sehingga tidak mengganggu proses pemisahan. 6. Purge dilakukan dengan cara memutar tombol drain berlawanan jarum jam, bersamaan dengan ditekannya tombol purge pada pompa. Sehingga eluen yang membawa gelembung akan keluar melalui pembuangan.
7. Pilih menu File lalu pilih new Method File. 8. Apabila belum memasukkan metode, harus menyettingnya dahulu di instrument parameter view.
9. Ketik kecepatan fase gerak Pump A Flow.
10. Ketik panjang gelombang analisa yang diinginkan pada colom wave length chl.
11. Ketik waktu analisa yang diperlukan pada kolom stop time
12. Klik file, save method file as… masukkan nama metode, klik save
13. Kirim perintah ke alat, klik Download
14. Klik instumen On/off.yang telah dibuat, klik download, lalu instrument on/off untuk menyalakan dan mematikan alat, tidak usah setting perhitungan.
15. Untuk membuka metoda yag telah dibuat, klik 2x methode
16. Setelah kondisi stabil artinya didiamkan atau warming up selama 15 menit, sampel diambil menggunakan syringe dan jaga samapai terdapat gelembung udara diadalamnya. Apabila terdapat gelembung udara, maka dilakukan teknik dengan cara mengeluar masukkan sample dalam syringe hingga gelembung tersebut hilang.
17. Untuk menginjekkan sample, klik single start
18. Masukkan nama sample, id sample dan juga data file.
19. Tunggu sampai ada tampilan data achquisition start.
20. Kemudian sample di injeksikan ke dalam colom.
21. Masukkan jarum syringe pada lubang sample, lalu ditekan perlahan hingga tak bisa ditekan lagi. Posisi syringe harus tegak lurus, lalu putar ke posisi load (naikkan ke atas), injeksikan sample, lalu injector diputar kembali ke posisi inject (turun ke bawah)
22. Hasil pemisahan akan dibawa ke dalam colom dan dibawa ke detector, sehingga ditampilkan pada layar monitor.
C. Diagram alir
D. Kelebihan dan kekurangan
1. Kelebihan dari HPLC
• mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
• mudah melaksanakannya
• kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
• dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
• Resolusi yang baik
• dapat digunakan bermacam-macam detektor
• Kolom dapat digunakan kembali
• mudah melakukan "sample recovery"
2. Kekurangan dari HPLC
a. Memerlukan biaya yang banyak untuk proses pemisahannya
b. Memerlukan orang yang trampil dalam proses pemisahannya.
BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Adapun kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan ini yaitu HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.
B. Saran
Adapun saran yang dapat diberikan dalam percobaan ini yaitu sebaiknya dalam pengoperasian ini lebih berhati-hati karena bahan yang dipergunakan sedikit dan harga barangnya relatif mahal.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2011. Laporan praktikum HPLC. http://www.scribd.com/doc/24898561/Laporan-Praktikum-HPLC-rtf (diunduh 2012/05/30)
Anonim. 2010. Laporan HPLC krisna. http://www.scribd.com/doc/92550514/LAPORAN-HPLC-KRISNA
http://www.scribd.com/doc/61788584/laporan-pelatihan-HPLC ( diunduh 2012/05/30).
Anonim. 2011. Laporan HPLC. http://instrumentituasyiklhoo.blogspot.com/2012/05/laporan-hplc.html ( diunduh 2012/05.29)
Semoga Anda lebih sukses lagi menimba dan membagi ilmu. prom Prof Tarmizi (Padang)
BalasHapustambahkan juga cara membaca kromatogram nya mba. terimakasih
BalasHapus